Linked testul immunosorbent (ELISA, elisa). Esența principiului metodei și a etapelor de cercetare. Analiza claselor de anticorpi de anticorpi, complexe imune.

În legătură cu dezvoltarea tehnologiei celulare, biologie moleculara, genetica, fizica, chimie si multe alte discipline de înaltă tehnologie în practica de zi cu zi de a introduce noi metode de înaltă precizie și de înaltă tehnologie. Aceste tendințe afectează și zona interdisciplinară a cunoștințelor medicale, și domenii conexe de probleme biologice, biochimice. larg răspândit și introducerea metodei pe scară largă diagnosticului clinic de laborator clinic, numit imunoenzimatică pentru ultimii zece ani.

În general, tehnologia reacțiilor imunologice enzimatice și radiologice utilizate pe scară largă în dactilografiere de celule, culturi de celule de țesuturi diferite de la începutul anilor '80 din secolul XX. Cu toate acestea, aceste metode au fost foarte consumatoare de timp, nu unificat, nu standardizate, care excludea utilizarea lor în scopuri terapeutice și de diagnostic în masă. Aceste metode folosesc un îngust, high-tech și de laborator foarte specializat.

Cu toate acestea, odată cu avansarea tehnologiei, Microtehnologie, fabricarea diferitelor materiale de biopolimeri făcut posibilă producerea de seturi gata făcute de ELISA de diagnosticare, care va fi capabil să utilizeze laboratorul instituțiilor medical generalist. ELISA este utilizat pe scară largă pentru diagnosticarea diferitelor infecții (chlamydia, sifilis, citomegalovirus, toxoplasmoza, herpes, etc.), atât acute cât și cronice, latente formele care au loc fără simptomov.Takzhe clinic această metodă este utilizată pentru controlul cronic boli. Să încercăm să înțelegem ce această metodă este și ce principii se bazează?

Componentele legate testul immunosorbent - răspunsul imun și reacția enzimatică

imunoenzimatice, așa cum sugerează și numele, este format din două componente diferite - reacții imune și reacții enzimatice. Răspunsul imun produce molecule de legare biologice, sau celule de microorganisme, care sunt de fapt încearcă să găsească, iar reacția enzimatică ne permite să vedem și să măsoare rezultatul unei reacții imunologice. Aceasta este, răspunsul imun - face parte dintr-o tehnica complexa, care detecteaza de fapt microb dorit. O reacție enzimatică - este acea parte a unei tehnici complexe, care permite să traducă rezultatul răspunsului imun în formă de ochi vizibile și accesibile măsurătorii tehnici chimice de rutină. Bazat pe o astfel de metodă structură immunoassay, analizăm separat ambele părți.

Răspunsul imun, care este? Ce este un anticorp, antigen?

Ce este un răspuns imun? Ce este un antigen?
În primul rând să analizeze ce răspunsuri imune. răspunsuri imune - o reacție de legare specifică a unui antigen cu un anticorp pentru a forma un complex imun. Ce înseamnă? Pe suprafața fiecărei celule a oricărui organism există structuri speciale numite antigeni. Antigenele în general - sunt molecule care transporta informatii despre celula (cum ar fi informații cu privire la o insignă la om, care specifică datele de bază ale persoanei).

antigene individuale și specifice - ce este? De ce avem nevoie de aceste antigene?

există antigeni individuali, care este unic pentru acest organism particular. Aceste antigene individuale sunt diferite de toți oamenii, există este similar cu unul de altul, dar încă diferite. Două exemplare identice de antigene individuale nu există!

Al doilea tip principal de antigen - este antigene specii, care este inerentă unei anumite specii de viețuitoare. De exemplu, o persoană care este prezent un antigen specific, care este comună tuturor oamenilor, la șoareci există o specie de antigen murine etc. Pe suprafața fiecărei celule sunt prezente în mod necesar specia și antigenul individuale.

Antigenul specific utilizat celule ale sistemului imunitar pentru recunoaștere „-. Altuia“

Cum este recunoașterea antigenului?

Celulele imune asociate cu celula suspecte si poarta de identificare este pe antigen individuale. Memoria celulelor imune „în scris“ arata ca „antigenul său.“ Astfel, în cazul în care celulele suspecte antigen se potrivesc descrierii „antigenul său“, aceasta înseamnă că celula propriului său corp și nu este gravă. Apoi, celula imunitar „dezlegat“ și pleacă. Și în cazul în care antigenul nu este același lucru ca și descrierea „o“, in timp ce celula imunitar identifică celula ca fiind „străin“ și, prin urmare, potențial periculoase pentru întregul organism. În acest caz, celula imunitar nu este „dezlegat“ și începe să distrugă obiectul periculos. Precizia unei astfel de recunoașteri imunologice este uimitor - 99.97%. practic, nici o greșeală!

Ce este un complex imun anticorp?
Ce este un anticorp?

Anticorpi - o moleculă specială localizată pe suprafața celulelor imune. Că anticorpul se leagă de antigen și celulele suspecte. Mai multe informații transferurile de anticorpi în celulă, în cazul în care recunoașterea, și primește un semnal de întoarcere a celor două tipuri de „un“ sau „adversar“. Când semnalul de „o“ comunicare perturba anticorpi cu antigenul și eliberează celula.

Ce este complex imun?
În cazul în care semnalul situația „străină“ se desfășoară în mod diferit. Anticorpul nu se rupe legătura cu antigenul, și vice-versa, prin trimiterea de semnale specifice, determină o „consolidare“. Biologic înseamnă că alți anticorpi în cealaltă parte a celulelor încep să se miște într-o zonă în care există un semnal de pericol, și, de asemenea, formează o legătură între un antigen și prins. În final, antigenul este înconjurat pe toate părțile și ferm anticorp privyazan.Takoy antigen + numit complex imun. Din acel moment, eliminarea antigenului. Dar acum detaliile procesului de neutralizare a antigenului nu ne interesează.

Tipuri de anticorpi (IgA, IgM, IgG, IGD, IgE)
Anticorp - o structura de proteine, care au respectiv denumirea chimică, care este folosit ca sinonim pentru exprimarea anticorpului. Astfel, Anticorpii sunt imunoglobuline =.

Există cinci tipuri de imunoglobuline (Ig), care se leaga de diferite tipuri de antigene în diferite locuri ale corpului uman (de exemplu, piele, mucoase, sânge, și așa mai departe. d.). Aceasta este, anticorpii au o diviziune a muncii. Aceste imunoglobuline sunt denumite alfabetul latin - A, M, G, D, E și sunt desemnate după cum urmează - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

In diagnosticul folosind doar un singur tip de anticorp, care este cel mai specific pentru microb definit. Aceasta este, legarea anticorpilor sunt definiți cu antigenul se întâmplă mereu. Cele mai frecvent utilizate IgG și IgM.

Acest răspuns imun principiu (specificitate unică și acuratețea recunoașterii determinate de obiectul biologic) stă la baza de anticorpi de înaltă precizie immunosorbent rezistență analiza.V care recunosc antigene, acuratețea tuturor metodei immunoassay este de asemenea superioară.

Reacția enzimatică

Ce reacție - enzimă? Care este substratul de afinitate și produsul?
Considerăm acum reacția enzimatică în metoda imunotestare enzimatică.

Care este reacția enzimatică?

Reacția enzimatică - o reacție chimică în care o singură substanță este transformată de enzima la alta. O substanță care acționează asupra enzimei numite substrat. O substanță care se obține prin impactul unei enzime numite produsul de reacție al. Caracteristica care a reacției enzimatice este că o anumită enzimă acționează numai pe un substrat specific. Această proprietate a enzimei de a recunoaște substratul „lor“ numit afinitate.

Astfel, fiecare enzimă poartă un singur, ca răspuns specifică. Enzimele din lumea biologică cunoaște o varietate mare, precum și reacții enzimatice. ELISA diagnostic folosește doar câteva reacții enzimatice - nu mai mult de 10. Când un astfel de produs de reacție enzimatica selectat care este substanțe colorate. De ce este reacția enzimatică de produse trebuie să fie vopsite? Deoarece nu există nici o metodă chimică simplă pentru calcularea concentrației de substanță a soluției colorate - colorimetrie.

Metoda colorimetrie - esența și principiul

colorimetrie utilizează măsurarea densității culorii soluției și prin concentrația calculată densitate de culoare veschestva.Pri acest dispozitiv special - măsuri colorimetru culoarea densitatea soluției. În colorimetrie două posibile densitate de culoare în funcție de concentrația substanței - este direct proporțională dependență sau invers proporțională. Direct proporțional, cu cât concentrația substanței, cu atât mai intensă densitatea culorii soluției. Invers proporțional, cu cât concentrația unei substanțe, cea mai mică culoarea densitatea soluției. Punct de vedere tehnic, acest lucru are loc după cum urmează: luate mai multe soluții de concentrație cunoscută densitatea substanței măsurată a acestor soluții, concentrația este reprezentată grafic pe densitatea culorii (Graficul de calibrare).

În continuare, se măsoară densitatea culorii soluției, concentrația care apare, iar graficul de calibrare sunt valoarea concentrației corespunzătoare nivelului de Colorimetrele automate moderne măsurată densitatea culorii rastvora.V odată ce calibrarea este efectuată, atunci unitatea se construiește o curbă de calibrare, care rămâne în memorie și măsurare în mod automat.

peroxidazei: Imunotestul este utilizat cel mai frecvent următoarele enzime fosfataza alcalină, avidină.

Deoarece imunologice combinate și reacția enzimatică în ELISA? Vom trece acum să ia în considerare imunoenzimatică actuale. Care sunt etapele pe care le include și ce se întâmplă atunci când aceste reacții? Linked immunosorbent assay este directe și indirecte.

Testul immunosorbent Direct legat - etapele

In ELISA directă folosind anticorpi pentru a identifica antigenul cuplat cu o anumită etichetă. Această etichetă special este un substrat al reacției enzimatice.

Atașarea antigenului la antigenul de suprafață și compusul godeurilor cu anticorpi

Cum imunotestare enzima directă? Luați materialul biologic (sânge, razuitura mucus, frotiuri) și plasate în godeuri speciale. Materialul biologic este lăsat în godeuri timp de 15-30 de minute la antigenele ar putea lipi de suprafața sondelor. Mai mult, în aceste sonde este adăugat anticorp pentru detectarea antigenului. Aceasta înseamnă că antigene de identificare, cum ar fi sifilis, a adăugat anticorpi împotriva antigenelor sifilis. Acești anticorpi sunt produși prin metode industriale și de laborator cumpăra amestec gata nabory.Dannuyu materialului și anticorpi se lasă timp de ceva timp (de la 30 minute până la 4-5 ore), la anticorpii au fost capabili de a găsi și de a lua legătura cu antigenom.Chem „lor“ mai mult în biologică antigenele proba, mai contactul anticorpi cu ei.

Eliminarea anticorpi „inutile“

După cum sa menționat, anticorpii sunt de asemenea legate de anticorpii specifici metkoy.Poskolku se adaugă în exces, nu toate dintre ele vor fi puse în contact cu antigene, iar dacă nu există nici un antigen în probă, apoi, în consecință, nici anticorpul nu în contact cu antigenul dorit. Pentru a elimina anticorpii „extra“, conținutul godeurilor doar turnat. Ca rezultat, anticorpi toate „exces“ sunt eliminate, și sunt cele asociate cu antigenii ca antigene „lipite“ la suprafața sondelor. Godeurile au fost clătite de mai multe ori cu o soluție specială, care vă permite să spălați toate anticorpii „extra“.

Reacția enzimatică - formarea unui compus colorat

Apoi începe faza a doua - o reacție enzimatică. Alveolele spălate au fost adăugate la soluția de enzimă și se lasă să stea timp de 30-60 minute. Această enzimă are o afinitate pentru o substanță (etichetă specifică), care este asociat cu anticorpul. Reacțiile enzimatice au fost efectuate, în urma căruia această etichetă special (substrat) este transformat într-o substanță colorată (produs). Apoi, metoda colorimetrie sunt că concentrația substanței colorate. Deoarece această etichetă specifică este asociată cu anticorpi, atunci concentrația produsului de reacție colorat este egal cu concentrația de anticorpi. O concentrație de anticorpi egal cu antigen concentrație. Astfel, în urma analizei, vom obține răspunsul, ceea ce este concentrația microb detectat sau un hormon.

Asta e ceea ce trece testul imunosorbent drept. Astăzi, cu toate acestea, mai multe sanse de a utiliza testul de imunosorbție indirectă, deoarece sensibilitatea și acuratețea indirectă mai mare decât directă. Deci, să imunoenzimatică indirectă.

imunoenzimatice indirectă - etapele

In testul ELISA indirect două etape. Pe parcursul primei etape se utilizează anticorpi nemarcați la un antigene detectabile, iar în a doua etapă este aplicată primilor anticorpi marcați cu anticorpi nemarcată. Acest lucru nu se obține legarea directă a anticorpului la un antigen, și un dublu-verificare: legarea anticorpilor la antigen, după legarea doilea complex anticorp cu un anticorp + antigen. De obicei, anticorpul pentru prima etapă - mouse-ul și pentru al doilea - capră.

Fixation de antigeni pe suprafața sondelor și legarea antigenului cu anticorpul nemarcați
La fel ca și pentru imunoenzimatică directă gard efectuat material biologic - pilitură de sânge, frotiuri. Investigat materialul biologic este adăugat în godeuri și lăsate să stea timp de 15-30 de minute pentru lipirea la antigenele de suprafață ale sondelor. Apoi, godeurile contribuie anticorpi nemarcați la antigeni și lăsate în timp (1-5 ore) la anticorpul pus în contact cu antigene „lor“ și complexul imun format (prima etapă). Apoi îndepărtați „excesul“, anticorpul nelegat prin turnarea conținutului sondelor. Clătire cu o soluție specială pentru îndepărtarea completă a tuturor anticorpilor non-legat.

Legarea anticorpului marcat la antigen, un anticorp neetichetat +
Apoi ia un al doilea anticorp - marcat, adăugate la godeuri și din nou lăsat să stea ceva timp - 15-30 minute (al doilea picior). În acest timp, anticorpii marcați se leagă la primul - care nu sunt etichetate și formează un complex - un anticorp + antigen + anticorp. Cu toate acestea, etichetate și anticorpul marcat sunt introduși în godeuri în exces. Prin urmare, este necesară încă o dată pentru a elimina „extra“, anticorpii deja marcate care nu se leagă la anticorpul nemarcat. Această procedură se repetă pentru turnarea conținutului sondelor și spălare cu o soluție specială.

Reacția enzimatică - formarea unui compus colorat
Apoi, introduce enzima de conversie efectuarea reacției „tag-uri“, într-o substanță colorată. Culoarea se dezvoltă în termen de 5-30 minute. Se efectuează apoi colorimetrie și calcularea concentrației substanței colorate. Deoarece concentrația substanței colorate este concentrația anticorpului marcat și concentrația trasorului este egală cu concentrația de anticorpi nemarcați, care, la rândul său, este egală cu concentrația de antigen. Astfel, se obține concentrația de antigen detectabil.
Un astfel de control dublu, folosind două tipuri de anticorpi îmbunătățite sensibilitatea și specificitatea testului imunosorbție legată de enzimă. În ciuda prelungirea timpului analizei și includerea unor etape suplimentare, aceste pierderi sunt rezultatul de precizie compensata. De aceea, în momentul în care marea majoritate a tehnicilor imunoenzimatice - aceasta este o imunotestare enzimatică indirectă.

Ce boli sunt detectate prin diagnosticare imunoenzimatică?

Să ne gândim acum ce fel de boală și orice substanță biologic activă detectată prin metoda imunoenzimatică. Substanțe detectate de imunoenzimatică sunt prezentate în Tabelul.


Tabelul de mai jos nu este o listă completă de teste (doar cele mai frecvente), realizată prin ELISA. Adu toata lista nu este posibil, deoarece va fi o foarte mare și actualizate în mod constant. În plus față de diagnosticul de laborator prin metoda imunoenzimatică este utilizat pe scară largă în cercetarea științifică.




Autor: AK Nasedkina