PCR (reacția în lanț a polimerazei). Cum este diagnosticul PCR, indicații, cum să se pregătească pentru studiu, rezultatele PCR

Pentru un tratament adecvat și eficient al multor boli infecțioase trebuie să fie în timp util pentru a stabili un diagnostic precis. În rezolvarea acestei probleme implicate astăzi metode de diagnosticare high-tech bazate pe metode de biologie moleculara. In acest moment, reacția în lanț a polimerazei (PCR) este deja utilizat pe scară largă în practica medicală ca instrument mai fiabile pentru diagnosticul de laborator.

Ce conturi pentru popularitatea de PCR în acest moment?

În primul rând, această metodă este utilizată pentru detectarea agenților patogeni ai diferitelor boli infecțioase cu mare precizie.

În al doilea rând, pentru a monitoriza eficacitatea tratamentului.

În diverse manuale, broșuri, articole și explicațiile specialiștilor medicali, suntem adesea se confruntă cu utilizarea de termeni și cuvinte obscure. Într-adevăr, este dificil să vorbim despre produse high-tech știință cuvinte obișnuite.

Care este esența și mecanicii PCR de diagnostic?

Fiecare organism viu are propriile sale gene unice. Genele sunt aranjate într-o moleculă de ADN, care de fapt este o „carte“ a fiecărui organism specific. ADN-ul (material genetic) - o molecula foarte lung, care constă din „cărămizi“ numite nucleotide. Fiecare excitatoare ei mint boli infecțioase strict specifice, adică într-o anumită ordine și combinații. Când este necesar să se înțeleagă dacă persoana are un anumit agent patogen, cațără material biologic (sânge, urină, salivă, tampon), care cuprinde un ADN sau fragmente de ADN microb. Dar cantitatea de material genetic al agentului patogen este foarte mică, și este imposibil de spus ce anume microorganismul el deține. Pentru a rezolva această problemă și servește ca PCR. Esența reacției de polimerizare în lanț este acela că o cantitate mică de material este luată pentru anchetă, care cuprinde ADN-ul, iar procesul de PCR este o creștere a numărului de material genetic care aparține unui agent patogen specific și, prin urmare, poate fi identificat.

diagnostice PCR - studiu genetic al biomaterial.

Ideea PCR apartine K.Mullins savantul american, pe care le-a propus în 1983. Cu toate acestea, utilizarea pe scara larga clinice a primit abia la mijlocul anilor '90 XXveka.

Vom înțelege terminologia care este - ADN-ul, etc. Fiecare celulă din fiecare creatură vie (animale, plante, umane, bacterii, viruși) are un cromozom. Cromozomii - deținătorii de această informație genetică, care cuprind întreaga secvență a genelor fiecărui individ lucru viu.

Fiecare cromozom este compus din două catene de ADN, răsucite într-o spirală în raport unul cu altul. ADN - acidul dezoxiribonucleic este chimic, care constau din componente structurale - nucleotide. 5 este specia de nucleotide - timină (T), adenozina (A), guanina (G), citozina (C) și uracil (U). Nucleotidele sunt dispuse unul în spatele celuilalt într-o succesiune strict de gene individuale de formare. O gena poate consta din 20-200 nucleotide astfel. De exemplu, gena care codifică pentru producerea de insulină, este format din 60 pb.

Nucleotidele sunt proprietatea complementaritate. Aceasta înseamnă că, contrar adenina (A) într-o catenă de ADN necesare este timină (T) la celălalt lanț, și guanina opuse (G) - citozină (C). Schematic, după cum urmează:
D - D
T - A
A - T
Această proprietate cheie de complementaritate pentru PCR.

In afara de ADN aceeași structură este ARN - acid ribonucleic, care diferă de ADN în care, în loc de timină, uracilul este utilizat în aceasta. ARN - informația genetică este custodele unor virusuri, numite retrovirusuri (cum ar fi HIV).

       moleculele de ADN și ARN poate fi „înmulți“ (această proprietate este folosită pentru PCR). Acest lucru are loc după cum urmează: cele două catene ale ADN-ului sau ARN-ului, se îndepărteze de la fiecare mână cealaltă, fiecare fir devine o enzimă specială, care sintetizează un nou lanț. Sinteza este principiul complementarității, adică, în cazul în lanț ADN original, în valoare de nucleotidă A, atunci va fi nou sintetizat T, în cazul în care T - atunci C, etc. Această enzimă „constructor“ special care are nevoie de „semințe“ pentru începutul sintezei - secvența de nucleotide 5-15. Această „semințe“ este definit pentru fiecare genă (gena chlamydia, mycoplasma, virusuri) experimental.

Astfel, fiecare ciclu de PCR constă din trei etape. Primul pas se produce unwinding a ADN-ului așa-numitul - adică separarea interconectată a două catene de ADN. În al doilea - este o „sămânță“ conexiune la site-ul ADN-ului. În cele din urmă, benzile de date extensie a ADN-ului, care se face fermentom- „constructor“. În prezent, acest proces complex are loc într-un singur tub și este format din cicluri repetitive de ADN definit de reproducere pentru a produce număr mare de copii care pot fi detectate ulterior prin metode convenționale. Aceasta este una dintre catenele ADN-ului pe care le primim sute sau mii.

Etapele studiilor PCR

Prelevarea de probe de material biologic pentru cercetare

Deoarece proba este un material diferit biologic, sângelui și a componentelor sale, urină, salivă, secreții ale mucoaselor, lichidul cefalorahidian, secreții ale suprafețelor plăgilor, conținutul cavitățile corpului. Toate Biotestări colectate instrumente de unică folosință, și materialul format închis într-un tub de plastic steril sau plasat pe un mediu de cultură cu transport ulterior la laborator.

Proba recuperată se adaugă reactivii necesari și a pus într-un termostat programabil - termocicler (cycler termic). Termociclerul PCR repetate de 30-50 de ori un ciclu format din trei faze (Denaturarea, recoacere și alungire). Ce înseamnă acest lucru? Luați în considerare detaliile.

Etapele reacției PCR folosesc impropriu, copierea materialului genetic

eu etapa PCR - Pregătirea pentru copierea materialului genetic.
Se produce la o temperatură de 95 ° C, catenele de ADN sunt separate, și ei pot sta „primer“.

„Primeri“ sunt produse prin metode industriale diverse asociații științifice și industriale și laboratoare cumpără gata făcute. „Sămânța“ pentru a identifica, cum ar fi Chlamydia, funcționează numai pentru Chlamydia, etc. Astfel, în cazul în care biomaterialul este testat pentru prezența infecției cu chlamydia, apoi amestecul de reacție este plasat „semințe“ pentru hlamidiy- dacă testarea biomaterialelor la virusul Epstein-Barr, și „sămânța“ pentru virusul Epstein-Barr.

II etapa - unirea materialului genetic al agentului infecțios și „sămânța“.
Dacă există un ADN definit de un virus sau bacterie, „semințe“, sta pe ADN-ul. Procesul de aderare „semințe“ este a doua fază a PCR. Această etapă are loc la o temperatură de 75 ° C

III etapa - copie a materialului genetic al agentului infecțios.
Acest proces de fapt, alungire sau propagare a materialului genetic, care are loc la 72 ° C Prin „semințe“ este adecvată enzimă „constructor“ și sintetizează o nouă bandă de ADN. Odată cu sfârșitul sintezei unei noi capete de lanț ADN și ciclul PCR. Adică, un număr de ciclu PCR este crescut de material genetic de două ori. De exemplu, în proba inițială a avut 100 molecule de ADN de orice virus, după primul ciclu de PCR din eșantion vor fi molecule ADN pentru virusul test de 200. Un ciclu durează 2-3 minute.

Pentru formarea unei cantități suficiente de material genetic pentru a identifica, au fost efectuate în general 30-50 de cicluri de PCR, care durează 2-3 ore.

Nivelul de identificare propagat material genetic

De fapt, PCR se termină aici și în continuare nu există nici un stadiu mai puțin semnificative de identificare. Pentru identificare folosind metoda de electroforeză sau etichetate „primer“. Atunci când se utilizează electroforeza ADN-ului obținute sunt separate prin mărime, iar prezența fragmentelor de ADN de lungime indică un rezultat pozitiv al analizei variabile (adică, prezența unui virus, bacterie, etc.). Când se folosește eticheta „semințe“, se adaugă cromogen (colorant) la produsul final de reacție, prin reacția enzimatică este însoțită de formarea culorii. Dezvoltarea culorii este o dovadă directă că un virus sau alt agent detectabil sunt prezente în proba originală.

Până în prezent, folosind eticheta „primer“, precum și software-ul adecvat, este posibil să se producă la o dată și „citi“ rezultatele PCR. Este atât de nazyvaemayareal-time PCR.

De ce diagnosticare PCR are această valoare?

Unul dintre avantajele semnificative ale metodei PCR este sensibilitatea ridicată a - 95 până la 100%. Cu toate acestea, aceste beneficii ar trebui să se bazeze pe întotdeauna în următoarele condiții:

1. eșantionarea corectă, transportul materialului biologic;
2. disponibilitatea de instrumente sterile, de unică folosință, laboratoare de specialitate și personal instruit;
3. respectarea strictă a tehnicilor sterile și în timpul analizei

Sensibilitatea variază pentru diferite bacterii detectate. De exemplu, sensibilitatea metodei PCR pentru detectarea virusului hepatitei C este de 97-98%, sensibilitatea pentru detectarea Ureaplasma - 99-100%.

Posibilitatile inerente analizei PCR, se poate realiza o specificitate analitică de neegalat. Aceasta înseamnă identificarea unui microorganism este ca cauta, nu sunt similare sau strâns legate.
Sensibilitatea diagnostică și specificitatea metodei PCR, de multe ori mai mari decât cele pentru metoda de cultură, numit „standardul de aur“ pentru detectarea bolilor infectioase. Având în vedere durata culturii în creștere (de la câteva zile la câteva săptămâni), avantajul PCR este evidentă.

PCR în diagnosticul infecțiilor
Avantajele metodei PCR (sensibilitate și specificitate) definesc o gamă largă de aplicații în medicina modernă.
Principalele aplicații de diagnosticare PCR:

1. Diagnosticul bolilor infecțioase acute și cronice ale diferitelor localizare
2. monitorizarea eficacității terapiei
3. clarificarea tipului de agent patogen

PCR este folosit in obstetrica, ginecologie si neonatologie si pediatrie, urologie, Venerologie, nefrologie, clinica boli infectioase, oftalmologie, neurologie, Ftiziopneumologie și colab.

diagnosticare PCR este realizată folosind în combinație cu alte metode de cercetare (ELISA, PIF, FIF și colab.). Combinația lor și determină caracterul adecvat al medicului curant.

agenți infecțioși detectate prin metoda PCR

viruși:

1. Retrovirusurile HIV-1 și HIV-2
2. viruși herpetiformă
3. virusul herpes simplex 1 și 2
4. citomegalovirus
5. Virusul Epstein-Barr
6. Varicelo - zosterian
7. herpes virusuri umane 6 și 7
8. hepatita C, B și A
9. viruși, papiloma uman
10. virusul rubeolei
11. adenovirusuri
12. rinovirusuri
13. parvovirusul
14. pikornovirusy

bacterii:

1. micobacteriilor
2. chlamydia
3. Mycoplasma
4. Salmonella
5. Legionella
6. clostridia
7. Treponema pal
8. Diferite tipuri de E. coli patogene
9. Vibrio cholerae
10. Rickettsia
11. aurococcus
12.  agentul cauzal al meningitei bacteriene
13. Helicobacter pylori
14. Ureaplasma
15. gonoree
16. difterie bacil
17. Haemophilus influenzae

În această listă sunt cele mai frecvente agenți infecțioși detectate prin PCR. De fapt, această listă este mult mai largă, actualizate în mod constant, astfel cum a sintetizat noi „semințe“. De asemenea, trebuie remarcat faptul că lista agenților patogeni identificați este determinată de prezența „semințe“ pentru identificarea în arsenalul fiecărui laborator.


Autor: AK Nasedkina